利用食蟹猕猴模型评估CAR-T细胞疗法安全性的方法的开发

没有使用适当的动物模型的 "非肿瘤毒性 "评估系统

日本医学研究与发展机构(AMED)6月4日宣布，它已经开发了一个灵长类动物模型，用于评估基因工程嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法的安全性。 这项研究是由京都大学理学院医学系的中泽洋三教授、京都府立医科大学研究生院(校内)的柳生茂树讲师和Ina Research Co.的高级执行官Akihito Shimoi领导的一个研究小组进行的。该研究成果已发表在《临床与转化免疫学》上。

CAR-T细胞已经商业化，用于治疗一些血液肿瘤，如白血病和恶性淋巴瘤，并在日本得到了应用。 CAR-T细胞的肿瘤外毒性发生在施用CAR-T细胞后的几小时至几天内，如果肿瘤外毒性发生在重要器官，如心脏、肺和大脑，则可能是致命的。因此，在开发时应充分评估肿瘤外毒性的可能性。

在传统的药物开发中，药物疗效和安全性研究是在啮齿类动物中进行的，而CAR-T细胞已被广泛地使用人类来源的肿瘤免疫缺陷小鼠模型进行评估。另一方面，由于CAR-T细胞靶向的蛋白质结构在人类和啮齿类动物之间有很大的不同，所以不能用啮齿类动物进行安全性研究来评估CAR-T细胞的肿瘤外毒性，这是开发新CAR-T细胞的一个障碍。 在人类细胞加工产品的临床前安全性研究中，当难以使用免疫力低下的动物(小鼠或大鼠)进行安全性研究时，人们认为可以使用动物来源的同等产品作为替代，或使用免疫抑制药物作用下的动物，但适当的动物种类和试验方法尚未确定。

以前的一项研究用吃螃蟹的猕猴作为模型，拒绝了人类衍生的CAR-T细胞

为了解决这个问题，研究小组报告了一种评估CAR-T细胞非肿瘤毒性的方法(自体移植模型)，即通过生成和施用食蟹猕猴的CAR-T细胞，食蟹猕猴与人类有高度的同源性，大部分蛋白质结构与人类高度共享。 在这份报告中，使用识别并杀死GM-CSF受体的CAR-T细胞评估了自体移植模型的安全性，GM-CSF受体在急性骨髓性白血病和年轻骨髓细胞白血病细胞中高度表达(GMR-CAR-T细胞)。

GMR-CAR-T细胞是在研究前14天用食蟹猕猴T细胞生成的，自体移植到同一只食蟹猕猴个体中，并观察14天。 移植后，食蟹猕猴外周血中的GMR-CAR-T细胞数量瞬时增加，但此后细胞数量逐渐减少。 用药后，食蟹猕猴的一般情况(一般状态)和食物摄入量没有变化，也没有发现发烧、体重减轻、呼吸和循环衰竭等严重症状。此外，在观察期间，血液和生化检查以及凝血功能检查没有出现可归因于CAR-T细胞影响的异常值。 此外，在给予GMR-CAR-T细胞后的第14天进行的病理检查没有发现任何暗示器官损伤的异常结果。

然而，这个自体移植模型是利用食蟹猕猴的T细胞生成CAR-T细胞，作为研究产品的替代品，并评估其安全性的一项研究。 因此，它不是使用实际调查产品的安全评估。 另一方面，当实际的研究产品(人类衍生的CAR-T细胞)被施用于食蟹猕猴时，这些细胞很快被食蟹猕猴的淋巴细胞介导的免疫反应所排斥。 因此，有必要开发一种方法来评估实际研究产品(人类衍生的CAR-T细胞)在食蟹猕猴体内的安全性而不被排斥。

开发CAR-T细胞不因事先服用免疫抑制药物而被排斥的食蟹猕猴模型

迄今为止，报告的CAR-T细胞的严重肿瘤外毒性大多在给药后几小时至几天内发生。因此，该研究小组开发了一个模型，通过提前给猕猴注射免疫抑制药物，将食蟹猕猴的淋巴细胞功能抑制数天，以防止异种人类CAR-T细胞的排斥反应(异种移植模型)。

事实上，给食蟹猕猴服用免疫抑制药物(氟达拉滨和环磷酰胺)，这些药物也被用作人类CAR-T细胞临床试验的预处理，使淋巴细胞计数下降到正常下限以下，而且淋巴细胞计数的抑制一直持续到CAR-T细胞给药后第7天。 淋巴细胞计数的抑制一直持续到CAR-T细胞给药后的第7天，但不影响中性粒细胞计数。 此外，在适当的支持性护理下，没有观察到由于使用免疫抑制剂而导致的不良事件(感染、恶心、呕吐、出血性膀胱炎等)。

没有观察到对正常器官的非肿瘤性毒性

利用这个模型，我们评估了针对EPHB4受体的CAR-T细胞(EPHB4-CAR-T细胞)的安全性，EPHB4受体在许多人类实体肿瘤中高度表达，包括恶性骨和软组织肿瘤以及乳腺癌，并参与其恶变。

首先，我们表明，人的EPHB4-CAR-T细胞能识别并杀死表达食蟹猴EPHB4受体的细胞。 接下来，我们将由人类T细胞产生的EPHB4-CAR-T细胞施用于免疫抑制的食蟹猕猴。 在给药24小时后，EPHB4-CAR-T细胞的数量在血液中暂时增加，但随后逐渐减少。 食蟹猕猴的一般情况(一般状态)和食物摄入量没有变化，也没有观察到严重的症状，如发烧、体重减轻、呼吸或循环衰竭。此外，在观察期间，血液和生化检查以及凝血功能检查没有出现可归因于CAR-T细胞影响的异常值。

已知EPHB4受体在发育阶段的正常人体组织中表达，在一些正常组织如成熟的血管内皮中表达较弱。然而，在研究的观察期间，没有与EPHB4-CAR-T细胞有关的明显异常发现。

在充分了解所开发的动物模型的问题和特点的基础上，选择一个合适的评价系统是很重要的。

到目前为止，由于缺乏使用适当动物模型的肿瘤外毒性的评估系统，CAR-T细胞的发展还没有得到充分的安全性评估。本研究中研究小组开发的自体移植和异种移植模型，利用人类和食蟹猕猴之间的高度同源性，能够对意外的严重肿瘤外毒性进行评估。 在CAR-T细胞的安全性评估中，在充分了解这些动物模型的特点的基础上，选择适当的评估系统，有望开发出具有高安全性以及高疗效的CAR-T细胞。

正在进行研究的 "信州大学基因和细胞治疗研究与发展中心(CARS)Ina研究实验室 "向开发再生医学产品的研究团体广泛开放。该研究小组说："预计CARS Ina研究实验室的使用将促进日本国内再生医疗产品的发展。