使用高度增殖的心肌细胞和iPS 细胞

京都大学 iPS 细胞研究所 (CiRA) 于 7 月 27 日发表了显示 HAND1 阳性细胞在诱导分化为心肌细胞过程的早期阶段显示心肌祖细胞，并且后期HAND1阳性 宣布细胞显示出高增殖能力，说明HAND1、HAND2和LEF1调节细胞增殖。这项研究是由CiRA増殖分化機構研究部門大久保周子研究員、吉田善紀准教授组成的研究小组进行的。研究成果在线发表于《干细胞报告》网络版。

由人类 iPS 细胞产生的心肌细胞有望应用于再生医学、药物发现研究和胚胎学。据说诱导 iPS 细胞分化为心肌细胞的过程模拟了发育，但具体机制尚不清楚。
 
已知转录因子 HAND1 和 HAND2 在小鼠发育过程中的心脏形成中起重要作用。即使在人类发育过程中，已知 HAND1 和 HAND2 的异常会导致心脏病，这表明它们对人类也很重要。还已知在人类中，HAND1在左心室中强烈表达，而HAND2在心房肌中强烈表达。然而，由于使用胚胎详细研究人类发育过程在伦理上是困难的，因此预计将通过使用 iPS 细胞的研究来阐明详细的机制。近年来，iPS 细胞已被用于创建心室和心房肌，但尚未详细研究 HAND1 和 HAND2 的表达动态及其功能。
 
因此，研究小组利用基因组编辑等技术，根据HAND1、HAND2和MYH6的表达水平，创建了三重报告iPS细胞，显示荧光蛋白mCherry、EGFP和iRFP670的荧光强度。 MYH6 是一种在心肌细胞中呈阳性的基因。使用这种三重报告细胞系系统，我们进行了研究，目的是阐明 HAND1 和 HAND2 在诱导人 iPS 细胞分化为心肌细胞的过程中的表达模式和作用。
 
创建三重报告 iPS 细胞，并在分化诱导早期确认 2 个种群，在晚期确认 4 个种群
为了观察HAND1和HAND2在诱导心肌细胞分化过程中的表达动态，课题组首先在iPS细胞上使用了CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在HAND1和HAND2位点的mCherry和EGFP（均发荧光） .通过引入蛋白质的基因序列制备双报告细胞系）。此外，使用piggyBac载体将MYH6基因的启动子和第三荧光蛋白iRFP670的基因序列导入细胞，制备三重报告iPS细胞系。在这个三重报告 iPS 细胞中，HAND1 表达由 mCherry 表示，HAND2 表达由 EGFP 表示，MYH6 表达由 iRFP670 表示。
 
这些三重报告 iPS 细胞被诱导分化为心肌细胞并用流式细胞仪观察。然后，在分化为心肌细胞前的第5天，有mCherry阳性细胞和阴性细胞两种群体，在分化为心肌细胞后的第20天，mCherry阴性EGFP阴性和mCherry阳性EGFP阴性。发现 - 阴性 EGFP 阳性和 mCherry 阳性 EGFP 阳性存在于四个群体中。
 
分化诱导早期的HAND1阳性细胞为心肌祖细胞
接下来，为了在第 5 天表征 mCherry 阳性和 mCherry 阴性细胞，研究小组收集了每个细胞并检查了对确定心肌细胞命运很重要的转录因子的表达。结果，发现这些基因在mCherry阳性细胞中高度表达。此外，对心肌祖细胞标志物PDGFRA和CD13（两种细胞表面蛋白）的免疫染色表明，mCherry的表达与这些因子的表达相关，HAND1阳性细胞为心肌祖细胞。出来了。
 
晚期 HAND1 阳性细胞是高度增殖的心肌细胞，CD105 是恢复标志物
当使用检测细胞增殖的EdU试剂检测mCherry阳性细胞和mCherry阴性细胞的EdU阳性率时，发现mCherry阳性细胞的阳性率较高，因此mCherry阳性细胞是具有高增殖能力的心肌细胞。因此，为了恢复具有高增殖能力的心肌细胞，我们在细胞表面寻找在 mCherry 阳性细胞中表现出高表达的蛋白质基因，并将重点放在 CD105 上。当从心肌细胞中分离出CD105阳性细胞和阴性细胞时，发现CD105阳性细胞的EdU阳性率高于CD105阴性细胞。综上所述，使用抗CD105抗体回收具有高增殖能力的心肌细胞成为可能。
 
虽然已知HAND1和HAND2在小鼠心脏的发育过程中起重要作用，但HAND1和HAND2的表达动力学以及HAND1和HAND2的表达动力学在人类发育和诱导人iPS细胞向心肌细胞分化中的作用没有详细调查。在本研究中，我们通过编辑基因组并制备 HAND1、HAND2 和 MYH6 的三重报告 iPS 细胞系来观察 iPS 细胞的表达动态。结果表明，HAND1阳性细胞是分化诱导早期的心肌祖细胞，HAND1阳性细胞是分化诱导后期的增殖能力强的心肌细胞。此外，发现CD105是恢复具有高增殖能力的心肌细胞的标志物。 该研究小组说“这些发现有望为人类胚胎学、再生医学中的有效移植疗法以及更有效的药物发现研究做出贡献”。